Makalah Kimia Analitik Kromatografi Lapis Tipis

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Lelakang

Didalam sebuah produk seperti cairan vitamin atau obat sejenis serta produk pangan lainnya terkadang sulit untuk membedakan dengan benar tentang unsur / zat yang terkandung didalamnya. Dengan adanya kemajuan teknologi dibidang elektrokimia saat ini telah memiliki peranan penting dalam menentukan berbagai kandungan / unsur zat didalam cairan. Adapun teknologi yang masih digunakan saat ini seperti penerapan metode kromatografi. Kromatografi ( Chromatography ) sebenarnya secara harfiah berasal dari nama "warna menulis", namun tak ada hubungan secara langsung kecuali senyawa pertama yang mengalami pemisahan dengan cara ini adalah pigmen hijau tumbuhan, seperti klorofil. Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu yang pertama, fasa tetap ( Stationary Phase ) dan kedua, fasa bergerak ( Mobile Phase ). Dengan adanya penelitianpenelitian baru yang memungkinkan untuk menerapkan prinsip kromatografi pada senyawa-senyawa yang tak berwarna termasuk gas.

Adapun perkembangan pesat dari beberapa jenis sistem kromatografi diantaranya adalah ; Kromatografi kertas, kromatografi lapisan tipis ( Thin Layer Chromatography ), kromatografi gas ( Gas Chromatography ), dan kromatografi cair kinerja tinggi ( High Performance Liquid Chromatography ).

Pada kromatografi lapisan tipis, terdapat lapisan tipis ( tebal 0.1-2 mm ) yang terdiri atas bahan padat yang dilapiskan kepada permukaan penyangga datar ( plat ), yang biasanya terbuat dari kaca, tetapi dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam. Lapisan yang melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat dan kromatografi lapisan tipis dapat digunakan untuk keperluan yang luas dalam pemisahanpemisahan. Seperti halnya, kromatografi lapisan tipis yang banyak digunakan akhir-akhir ini oleh sebagian besar laboratorium di Indonesia menggunakan alat berupa TLC Scanner 3 merk CAMAG ( Made in Switzerland ) dengan metode kromatografi lapisan tipis, yang mana proses pengambilan sample yang berada pada permukaan plat (tempat sample yang telah dilakukan pemisahan) menggunakan scanner didalam alat tersebut kemudian hasilnya ditransfer ke PC dan dilakukan proses selanjutnya. Dan kelebihan dari TLC Scanner 3 CAMAG sendiri adalah mampu menganalisa senyawa berwarna dan tak berwarna, membutuhkan waktu yang relatif cepat.

1.2 Rumusan Masalah

1.      Apa yang dimaksud dengan kromatografi ?

2.      Apa yang dimaksud dengan kromatografi lapis tipis ?

3.      Apa kelebihan dan kekurangan kromatografi lapis tipis ?

4.      Bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis ?

5.      Apa yang dimaksud dengan kromatogram ?

6.      Apa yang dimaksud dengan fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis?

7.      Bagaimana prosedur kerja dengan kromatografi lapis tipis ?

8.      Bagaimana cara mendeteksi bercak pada kromatografi lapis tipis ?

9.      Apa saja yang mempengaruhi analisis kromatografi lapis tipis ?

10.  Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam bidang pangan ?

1.3 Tujuan Penelitian

1.      Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan kromatografi.

2.      Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan kromatografi lapis tipis.

3.      Mengetahui apa kelebihan dan kekurangan kromatografi lapis tipis.

4.      Mendeskripsikan bagaimana prinsip keja kromatografi lapis tipis.

5.      Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan kromatogram.

6.      Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis.

7.      Mendeskripsikan bagaimana prosedur kerja dengan kromatografi lapis tipis.

8.      Mendeskripsikan bagaimana cara mendeteksi bercak pada kromatografi lapis tipis.

9.      Untuk mengetahui apa saja yang mempengaruhi analisis kromatografi lapis tipis.

10.  Untuk mengetahui bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam bidang pangan.

1.4 Metode Penelitian

Metode yang di gunakan dalam penyusunan makalah ini merupakan metode tinjauan kepustakaan yang bertujuan untuk mempelajari buku-buku yang relevan dengan masalah yang di teliti serta melakukan tinjauan langsung terhadap objek pengamatan yang dilakukan pada saat praktikum kimia analitik. Penelitian ini dilakukan untuk bagaimana aplikasi Kromatografi Lapis Tipis dalam bidang pangan.

1.5 Manfaat Penulisan

1.      Bagi Pemerintah

Bisa dijadikan sebagai sumbangsih dalam meningkatkan kualitas ketahanan pangan Indonesia serta agar terus mengembangkan teknologi yang menunjang pada penelitian dalam bidang pangan.

2.      Bagi Dosen

Bisa dijadikan sebagai acuan dan sumbangsih dalam mengajar terutama pada materi ini agar para peserta didiknya dapat berprestasi lebih baik dimasa yang akan datang.

3.      Bagi Mahasiswa

Bisa dijadikan sebagai bahan kajian belajar dalam rangka meningkatkan prestasi diri.

BAB II

PEMBAHASAN

2.1  Kromatografi Secara Umum

2.1.1 Pengertian Kromatografi

Kromatografi di tahun 1903 Tswett menemukan teknik kromatografi. Teknik ini bermanfaat sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi apabila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi ke dalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau di dalam pori. Ini adalah sorpsi (penyerapan). Laju perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu di dalam kolom atau lapisan tipis zat penyerap secara langsung berhubungan dengan bagian molekul-molekul tersebut diantara fase bergerak dan fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secara selektif, maka masing-masing komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang tergantung pada karakteristik masing-masing penyerapan. Jika pemisahan terjadi, masing-masing komponen keluar dari kolom pada interval waktu yang berbeda, mengingat bahwa proses keseluruhannya adalah fenomena migrasi secara diferensial yang dihasilkan oleh tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase bergerak.

2.1.2 Klasfikasi Metode Kromatografi

Metode-metode kromatografi tidak dapat dikelompokan dengan hanya meninjau suatu macam sifat. Artinya kita dapat menyatakan teknik-teknik kolom seperti destilasi, ekstraksi pelarut, penukar ion ke dalam satu kelas, tetapi teknik tersebut dapat juga diklasifikasikan dengan berdasarkan metode-metode differential migration. Pada semua metode differential migration, pemisahan berbagai komponen campuran yang bermigrasi pada berbagai medium tergantung pada karakteristik laju individual komponen-komponennya, sehingga dapat dikatakan bahwa dalam kalsifikasi, sesungguhnya terjadi tidak hanya satu sifat fisis saja yang ditinjau tetapi ganbungan-gabungan yang digunakan dalam teknik pemisahan. Semua metode-metode pemisahan dapat diklasifikasikan seperti dalam tabel 2.1, didasarkan pada sifat fisiknya dan pemisahan fasenya.

Tabel 2.1 Klasifikasi Kromatografi

No	Dasar	Pemisahan fase kedua		Memebedakannya dalam fase tunggal
		Dengan panas	Dengan reagen	Dengan bidang batas	Konsentrasi tidak seragam
1.	Penguapan	Destilasi		-	-
2.	Koefisien partisi	-	Kromatografi gas	-	-
3.	Penukaran	-	Penukar ion	-	-
4.	Aktivitas permukaan	-	Adsorpsi pada kromatografi gas-padat	-	Foam fraction
5.	Ukuran molekuler	-	Moleculer sieve Filtrasi gel Analisis eksklusi ion	-	-
6.	Migrasi listrik	-	-	-	Elektro foresis

Dibandingkan dengan metode pemisahan secara keseluruhan, klasifikasi metode kromatografi, relative lebih sederhana. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan, sedangkan fas diam dapat berupa zat cair atau padat. Jadi kita memiliki kombinasi cair-cair, gas-cair, gas-padat. Jika pemisahan terutama meliputi suatu partisi sederhana antara fase diam cair dan fase gerak cair juga, maka proses ini dikenal sebagai kromatografi partisi. Jika gaya fisika ke permukaan terutama meliputi kemampuan retensi dari fase diamnya, maka proses disebut sebagai kromatografi adsorpsi. Jika fase bergeraknya adalah gas, metode ini disebut sebagai kromatografi gas cair atau kromatografi gas-padat.

Untuk senyawa yang mudah menguap, kromatografi gas merupakan cara yang menawarkan resolusi tinggi, waktu analisis pendek dan kepekaan di daerah ppm. Metode kromatografi cair memanfaatkan fase gerak cair untuk menggeser sampel sepanjang kolom partisi yang diisi oleh pengadsorpsi padat atau zat padat yang diselimuti cairan seperti dalam HPLC. Di dalam kromatografi, pertukaran ion ikatan kimia heteropolar terbentuk secara reversible antara komponen-komponen ion di dalam fase bergerak dan fase diam. Penyerapan gel atau filtrasi gel adalah suatu contoh kromatografi eksklusi. Kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis adalah contoh-contoh kromatografi partisi. Suatu deskripsi singkat dari berbagai metode pemisahan akan dibahas berikut ini untuk mengetahui prinsip-prinsip dasar dan aspek-aspek analitik masing-masing metode.

a.    Destilasi : ini adalah penguapan zat cair dan kondensasi dari uap kembali ke fase cair. Penguapan zat cair sebanding dengan tekanan uapnya dan berbanding terbalik terhadap titik didih cairnya. Sublimasi juga suatu metode pemisahan baik. Keberhasilan metode ini tergantung pada kemudahan massa transfernya dilaksanakan jika zat berada dalam fase gas.

b.   Ekstaraksi pelarut.

c.    Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusizat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram. Prinsip kromatografi adsorpsi berhubungan juga dengan bidang-bidang lain seperti kromatografi zat padat. Pemisahan campuran ionik atau bermutan dengan differential migration dibawah pengaruh gaya pendorong potensial listrik telah dikembangkan. Pertama meliputi migrasi bebas dalam medium homogen dan migrasi kedua yang terjadi pada medium berpori yang stabil. Pertama disebut sebagai elektrofase dan yang kedua dikenal sebagai ionoforesis atau elektromatografi. Teknik yang kedua banyak diapakai dalam pemisahan.

d.   Teknik ring oven : teknik ini berkaitan dengan pengujian suatu tetesan tunggal larutan pada suatu kertas menyaring untuk mengetahui komponen-komponen larutan. Larutan ditetesi satu kali pada pusat kertas saring (yang berbentuk lingkaran), kemudian satu atau beberapa komponen sampel akan terekat pada kertas dengan pengendapan. Komponen-komponen terlarut dipindahkan dengan pelarut yang tepat sehingga bergeser dari pusat sampai bagian tepi kertas saring. Begitu larutan mencapai bagian tepi, penguapan pelarut terjadi dan zat terlarut akan tertinggal pada suatu area dalam bentuk cincin-cincin yang manunjukkan bahwa pemisahan dari bercak tetesan mula-mula.

e.    Zone melting : di sini dua wilayah tertentu yang meliputi penampang lintang suatu zat padat dilelehkan dengan perlahan-lahan digerakkan sepanjang batang zat padat. Zat terlarut akan dibebaskan pada saat pembekuan pada bidang batas padat-cair dan terbawa sepanjang wilayah serta akan menggumpal pada salah satu ujung zat padat. Imi merupakan proses selektif untuk mengluarkan pengotor.

f.    Penukar ion. Dalam ekslusi sifat-sifat fisika materi sintetik baru memberikan suatu era baru terhadap pemekaian materi-materi tersebut dalam pemisahan secara difusi. Misalkan dalam pengaliran larutan dengan pelarut air melalui resin, zat yang bersifat non ionik akan mendistribusikan dirinya sedemikian rupa sehingga dapat melalui fase resin, sedangkan yang senyawa ionik ditolak dari fase resin.

g.   Dialisis : osmosis adalah proses pemisahan berdasarkan difusi yang paling dikenal dan ini disebabakan aliran spontan sutu pelarut melalui membrane dari larutan yang encer ke larutan yang lebih pekat. Membrannya bersifat semi permeabel terhadap partikel zat terlarut. Dialisis dan osmosis sering kali terjadi secara spontan di dalam system. Dengan dialisis garam-garam dapat dipisahkan dari suspense koloid.

h.   Presipitasi, kopresipitasi dan sebagainya. Ini adalah suatu proses dimana suatu zat terlarut diubah ke bentuk tidak larut yang selanjutnya dapat dipisahkan dari larutannya.

i.     Flotasi : senyawa-senyawa dengan kerapatan lebih besar dari pada cairan yang menyelimutinya dapat dikonsentrasikan pada permukaan zat cair. Ini dikenal sebagai pemisahan dengan teknik flotasi. Pengaliran udara melalui larutan diperlukan pada metode ini. Suatu partikel dapat distabilkan pada permukaan seperti bidang batas permukaan gas-cair jika suatu kontak antara padatan dan cairan nilainya tertentu. Perbedaan sudut kontak ini menghasilkan flotasi selektif. Bagaimanapun hanya metode kromatografi yang mempunyai peranan sangat berarti dalam analitik.

2.1.3 Terminologi Kromatografi

Kromatografi dapat dilukiskan dengan berbagai istilah. Istilah yang paling sering dijumpai adalah nilai R_f juga dikenal sebagai faktor retardasi, atau dinyatakan juga sebagai volume retensi (V_R) atau waktu retensi (t_R). semua ini adalah suatu besaran yang menyatakan berapa lama fraksi waktu molekul zat terlarut tinggal dalam fase bergerak. Masing-masing senyawa mempunyai nilai R atau V_R yang berbeda dengan berubahnya kombinasi pelarut penyerap. Suatu koefisien partisi (K_d) menyatakan konsentrasi zat terlarut dalam tiap fase. Jika C_s, C_M adalah konsentrasi zat terlarut dalam fase diam dan fase bergerak, maka K_d = C_c / C_m. faktor retardasi (R_f ) menyatakan perbandingan kecepatan pergeseran zat terlarut terhadap senyawa standar ideal yang tidak terlarutkan ataupun yang tidak teradsorpsi oleh fase diam. Berarti untuk zat senyawa standar K_d = 0, sedangkan R adalah

Jika t_m, t_s adalah waktu tinggal molekul di dalam fase bergerak dalam fase diam. Jika penampang lintang dan K_d  tidak konstan sepanjang lintasan zat terlarut, kita memiliki R_f sebagai berikut :

Karena kecepatan gerak zat pelarut lebih besar dari pada fase bergerak, maka R lebih besar dari R_f  sebesar 15%. Jika R adalah fraksi zat terlarut pada keadaan kesetimbangan pada fase berserak, maka (1- R) adalah fraksi zat terlarut pada keadaan kesetimbangan di fase diamnya. Maka :

Dimana : C_M = volume fase bergerak
                V_M = konsentrasi fase bergerak
                C_S = volume fase diam
                V_S = konsentrasi fase bergerak

Pada kromatografi adsorpsi V_s dapat menggantikan A_s dan dipunyai

Jika A_s adalah luas daerah fase diam. Persamaan untuk faktor retardasi adalah mirip dengan %E, persen ekstraksi dalam ektraksi pelarut yang menyatakan

, maka

Karena D ≈ K_D, sedangkan V_w dan V_o adalah volume fase air dan fase organic. Dalam suatu kromatografi kolom, maka terdapat volume yang cukup berarti dari fase gerak yang meninggalkan kolom pada saat jumlah zat terlarut mencapai maksimum ketika meninggalkan kolom. Keadaan puncak maksimum zat terlarut dicapai pada saat seoaruh zat terlarut sudah terelusi dengan volume retensi V (juga dikenal dengan V_maks) dan separuh lainnya masih tinggal di dalam kolom pada fase gerak VM + Vs dimana

V_R C_M = V_M C_M + V_S C_S

V_R = V_M + V_S  x K_d

2.1.4 Prosedur Kromatografi

Untuk melaksanakan pemisahan secara kromatografi kolom, ada tiga cara dapat dilakukan :

a)   Analisi frontal

b)   Analisis elusi

c)   Pergeseran

Dalam arus kromatografi, effluent dikumpulkan dalam fraksi-fraksi yang berbeda dan masing-masing komponen terdeteksi dalam aliran effluent. Pada analisis frontal, larutan contoh dilewatkan secara kontinu melalui pengadsorpsi. Pusat-pusat aktif mengadsorpsi akan di duduki oleh komponen yang lebih kuat teradsorpsi sedangkan komponen yang kurang kuat teradsorpsi berakumulasi pada fase yang bergerak. Pada mulanya pelarut murni dan zat telarut A yang teradsorpsi  paling lemah akan meluncur ke luar kolom. Jika di plotkan %E terhadap volume effluent, maka diperoleh suatu kurva yang berbentuk tangga, dimana bagian datarnya menyatakan keluarnya suatu komponen zat terlarut. Pada zat-zat terlarut yang sedikit teradsorpsi, analisis frontal akan memeberikan hasil yang baik bila kolomnya sempit dan volume yang digunakan kecil. Analisis elusi adalah teknik yang paling popular. Eluent (dapat saja pelarut murni) dilewat melalui kolom yang dapat menyebabkan differential migration zat-zat terlarut dalam fase bergerak. Jika laju alirannya tertentu, maka pemisahan tergantung pada K_D. Jika masing-masing komponen mempunyai perbedaan  K_D besar, masing-masing komponen akan terpisah sempurna. Pada teknik penggeseran, pemisahan tercapai dengan mengalirkan suatu reagen yang teradsorpsi lebih kuat ke dalam kolom. Agen penggeseran ini teradsorpsi dan konsentrasi pada suatu wilayah puncak kolom. Semua komponen sampel terdorong keluar dan oleh pergerakan maju agen penggeser sepanjang kolom. Terbentuklah wilayah-wilayah dengan kekuatan penyerapan yang makin menurun. Komponen yang paling lemah terikat akan keluar pertama dari kolom sedangkan agen penggeser akan keluar terakhir. Keuntungan teknik ini adalah kolom dapat diisi dengan sampel cukup banyak. Untuk tujuan prepatatif, kadang kala pemisahan yang sempurna tidak tercapai, meskipun tailing sudah diusahakan seminimum mungkin. Metode penggeseran sangat bermanfaat dalam kromatografi partisi.

Elusi secara bertahap (gradient elution) merupakan salah satu variasi kondisi elusi selama terjadinya pemisahan. Pada kroatografi gas, cairan dengan kemampuan menggeser lebih kuat digunakan. Dengan cara demikian pelebaran pita dan waktu elusi yang terlalu lama dapat dihindarkan.

2.1.5 Dinamika Kromatografi

Efektivitas pemisahan tergantung pada penguraian komponen-komponen pada saat komponen tersebut berpindah dan kepadatan wilayah yang ditempati komponen-komponen tersebut. Oleh karena itu ukuran efisiensi kolom dapat dinyatakan oleh jumlah piringan :

W = lebar puncak elusi

W_e = lebar kurva elusi kesetimbangan (yaitu tengah – tengah jarak C_max dan W)

Kolom dapat dibagi atas sejumlah piringan dimana dianggap kesetimbangan sempurna terjadi antara fase bergerak dan fase diam pada masing-masing piringan. Jumlah piringan dan tinggi piringan adalah suatu indeks efisiensi kolom yang berguna untuk menggambarkan seberapa jauh suatu puncak dan wilayah pita telah melebar sebagai akibat fenomena transpor fisika. Biasanya tinggi piringan dinyatakan sebagai ∆ atau H = L/N.

Tingkat pemisahan dua komponen adalah suatu masalah yang umum dijumpai dalam semua metode kromatografi. Pada prakteknya yang dapat dilakukan adalah meminimalkan tumpangsuh (overlap) atau kontaminasi timbal balik antara wilayah-wilayah yang berdekatan ke suatu tingkatre solusi eksperimental yang dikehendaki, yaitu :

Z = pemisahan pusat wilayah atau puncak Gaussian dan = deviasi standar zona.

Jika R_s < 1,0, tumpangsuh (overlap) terjadi. Kontaminasi terjadi terutama pada titik tengah antara wilayah tumpangsuh pada jarak dibawah jarak 2 , yaitu 2%, R_s = 1,5 tidak ada kontaminasi timbal balik. Dapat dikatakan :

Dimana W₂ dan W₁ = lebar pucak rata-rata. Pada umumnya makin besar jumlah piringan makin baik resolusinya. N dapat diperbaiki dengan memeperpanjang. Tetapi memperpanjang kolom saja tidak bermanfaat. Yang lebih baik adalah memperbesar jumlah piringan dan penampang kolom yang sempit.

Untuk memperoleh analisis yang sempurna diperlukan pemilihan kondisi sehingga nilai waktu retensinya tidak terlalu besar. Unutk analisis effluent secara kontinu, perlengkapan otomatis dan kolektor fraksi sangat tepat digunakan. Hendaknya yang diukur merupakan sifat yang berfungsi secara linear terhadap sifat fase bergeraknya. Jumlah total dari zat terlarut yang terelusi diukur dari luas puncak kurva elusi.

2.2 Definisi Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman, 2007).

KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Hostettmann et al, 1995).

Pada proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda.

Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan  yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita, setelah pelat/lapisan ditaruh dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan dengan menggunakan sinar UV (Sudjadi, 1988).

Teknik ini dikembangkan tahun 1938 Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan menyerap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini di kenal  juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel, tetapi kadang kala bubuk selulosa dan tanah diatome juga dapat digunakan. Untuk fase diam hidrofilik dapat digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji, disperse koloid plastic, silica terhidrasi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada pengadsorbsi digunakan suatu aplikator. Sekarang inin telah banyak tersedia kromatografi lapisan tipis siap pakai yang dapat berupa gelas kaca yang telah terlapisi, kromatotube, dan sebagainya. Kadar air dalam lapisan ini harus terkendali agar didapat hasil analisis yang reprodusibel.

Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikro-syringe (penyuntik berukuran mikro). Sample diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi. Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertical searahgerakan pelarut. Teknik ascending  digunakan untuk melaksanakan pemisahan yang dilakukan pada temperature kamar, sampai permukaan pelarut mencapai tinggi 15-18 cm. waktu yag diperlukan antara 20-40 menit. Semua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat di pakai juga untuk kromatografi lapis tipis. Resolusi KLT juah lebih tinggi daripada kromatografi kertas karena laju difusi yang luar biasa kecilnya pada lapisan pengadsorpsi. RRPC dapat juga dilakukan pada kromatografi lapisan ini, dengan menggunakan lapisan yang sudah dicelupkan lebih dahulu pada perafin, minyak silikon, dan lain-lain. Pelarut yang digunakan adalah CH₃COOH atau asetonitril. Kadangkala untuk RPPC, waktu yang diperlukan cukup lama.

Zat-zat warna dapat terlihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagent penyemprot untuk melihat bercak suatu zat. Asam kromat sering digunakan untuk zat organic. Demikian juga penandaan secara radiokomia juga dapat digunakan. Untuk menempatkan posisi suatu zat, reagent dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagent dengan pengerokan setelah pemisahan selesai.

Untuk analisis kuatitatif dapat digunakan plot fotodensitometri. Analisisnya dapat dilakukan dengan spektrofotometer UV, sinar tampak, IR atau flourosens atau dengan reaksi kolorimeter dengan reagent kromogenik.

Aplikasi KLT sangatlah luas. Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. Ia dapat pula untuk memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Ahli kimia foresik menggunakan KLT untuk bermacam pemisahan. Pemisahan berguna dari plasticizer, antioksidan, tinta dan formulasi zat pewarna dapat ditentukan dengan KLT. Pemakaiannya juga meluas dalam pemisahan anorganik.

2.3 Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa kelebihan KLT yaitu:

1.      KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.

2.      Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

3.      Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.

4.      Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

5.      Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

6.      Biaya yang dibutuhkan terjangkau.

7.       Jumlah perlengkapan sedikit.

8.      Preparasi sample yang mudah

9.      Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adapun kekurangan KLT  yaitu:

1.      Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang diharapkan.

2.      Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.

3.      Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun

2.4 Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang (Watson, 2010). KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas.

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

2.5 Pembuatan Lapisan Tipis

Penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik, biasanya digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi. Seringkali bentuk plat kaca  / aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai “standard”.  Hal yang penting yaitu bahwa permukaan dari plat harus rata.  Plat -plat kaca / aluminium sebelum dipakai dicuci terlebih dahulu dengan air dan detergent kemudian dikeringkan. Terakhir, dapat dicuci dengan aseton, tetapi hal ini tidak mesti dilakukan. Satu hal yang perlu diperhatikan jangan menyentuh permukaan dari plat yang bersih dengan jari tangan karena bekas jari tangan yang menempel akan merubah tebal dari permukaan penyerap pada plat.

Untuk membuat penyerap, pertama bahan penyerap dicampur dengan air sampai menjadi bubur, biasanya dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk sampai rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara. Tebal lapisan merupakan faktor yang paling penting dalam kromatografi lapisan tipis. Tebal standard adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal ( 0.5  -  2.0 mm ) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap  hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm. Salah satu kesukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bila kering. 

Tabel 2.2 Perbandingan untuk membuat bubur penyerap

Penyerap	Medium bubur penyerap	Perbandingan, gram dalam ml
Silika gel	Metilena klorida : methanol (2:2, v/v)	35 gr dalam 100 ml
Serbuk selulosa	Metilena klorida : methanol (50:50, v/v)	50 gr dalam 100 ml
Alumina	Metilena klorida : methanol (70:30, v/v)	60 gr dalam 100 ml

Sifat yang terpenting dari penyerap adalah besar partikel bubur penyerap dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap plat sangat tergantung pada kedua sifat tersebut. Besarnya partikel yang biasa digunakan adalah 1  –  25 mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus. Sedangkan dalam kolom partikel yang sangat halus akan mengakibatkan aliran  pelarut menjadi lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih cepat.  Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan-pemisahan dalam kromatografi lapisan tipis adalah sebagai berikut :  

Tabel 2.3 Macam-macam penyerap untuk kromatografi lapisan tipis

Zat padat	Digunakan untuk memisahkan
Silika	Asam- asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, minyak esensial, anion, dan kation organic, sterol, terpenoid.
Alumina	Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-vitamin, karoten, asam-asam amino
Kieselguhr	Gula, oligosakarida, asam- asam lemak, trigliserida, asam -asam amino, steroid.
Bubuk selulosa	Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida
Pati	Asam-asam amino
Sephadex	Asam-asam amino, protein

2.6 Definisi Kromatogram

Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.
               

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Gambar menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari lempengan. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

2.7 Fase Diam dan Fase Gerak

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Silika gel salah satu contoh fase diam yang  terbentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.

Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada dasarnya sifat serta penggunaannya mirip silika gel.

Tabel 1. Fase diam yang sering digunakan pada KLT (Kealey dan Haines, 2002)

Fasa Diam	Mekanisme Sorpsi	Penggunaan
Silika gel	Adsorpsi	Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid
Serbuk selulosa	Partisi	Asam amino, nukleotida, karbohidrat
Selulosa penukar ion	Pertukaran ion	Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion logam
Gel sephadex	Eksklusi	Polimer, protein, kompleks logam
Β-siklodekstrin	Interaksi adsorpsi stereospesifik	Campuran enansiomer

Adsorben yang sering digunakan antara lain :

a)      Silika gel

Yang paling banyak digunakan dalam pengujian, bersifat asam lemah, sering ditambah CaSO4 (gibs) sebagai pengikat agar melekat kuat pada penyangga. Penambahan ini juga mempercepat mengeringnya lapis tipis. Juga dapat ditambahkan indicator fluoresensi yang akan berfluoresensi di bawah sinar UV pada 254 nm, hingga noda yang mengabsorpsi pada frekuensi ini menjadi sangat kontras terhadap latar belakang yang berfluoresensi hijau kuning. Silica gel sangat higroskopis, pada humaditas relative 45 – 75% akan menarik air sampai 7 – 20%. Derajat diaktivasinya ditentukan oleh kelembaban ruangan dimana pemisahan akan dilakukan atau tempat penyimpanan lapis tipisnya. Kemurnian juga penting karena dapat mempengaruhi watak kromatografi beberapa senyawa tertentu. Pencemar dalam adsorben ini dapat juga menyebabkan dekomposisi senyawa yang hendak dianalisa.

b)      Alumina

Bersifat basa lemah. Tidak sebaik silica gel dan lebih relative secara kimia hingga untuk senyawa yang sensitive dapat terdegrasi. Juga dapat ditambah Ca2SO4 dan indicator fluoresensi.

c)      Kieselguhr (tanah diatome)

Merupakan adsorben netral dengan aktivitas rendah. Daya resolusinya juga kecil. Dapat ditambahkan sebagai campuran pada silikagel yang akan memberikan adsorben campur yang kurang aktif. Juga dapat ditambah Ca2SO4.

d)     Selulosa

Dengan menggunakan selulosa sebagai adsorben akan didapat lapis tipis yang sifatnya analog dengan kromatografi kertas. Memberikan lapis tipis yang baik tanpa pengikat. Adsorben ini dapat ditambah indicator fluoresensi atau Ca asetat. Kerugian penggunaan selulosa ini ialah tidak dapat digunakannya pereaksi yang korosif seperti asam sulfat atau pereaksi destruktif lainnya.

e)      Poliamida

Merupakan magnesium silikat. Daya melekatnya tidak sebaik adsorben lainnya. Biasanya ditambahkan pengikat seperti selulosa atau amilum. Mempunyai kapasitas yang besar dan banyak digunakan untuk pemisahan fenol.

Selain fasa diam, dalam KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara  kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis  adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like” (Watson, 2010).

2.8 Prosedur Kerja dengan Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel ditempatkan di atasnya. Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis pada fasa diam berguna untuk menunjukkan posisi asli sampel. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fasa gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.

Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.

Diagram menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak sekitar setengah jalan. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-­reaksi warna. Untuk identifikasi menggunakan harga R_f meskipun harga-harga R_f dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga R_f didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):  

Harga-harga R_f untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga­-harga R_f yang diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daf­tar dari harga-harga R_f untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh (Gritter et al, 1991).

2.9 Deteksi Bercak

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:

1.      Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel akan berpendar.

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika disinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan,, kita harus menandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan  pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Karena jika  kita  mematikan sinar UV tersebut, bercak-bercaknya tidak tampak kembali.

2.      Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

2.10 Instrument Kromatografi Lapis Tipis

1.      Detektor

Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers. Komponen didalam phot omultipier (PMT) sendiri adalah photomultiplier tube (tabung vakum photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari bahan logam multi alkali), struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda (memilki spectral sensitivity 185-850 nm). 

Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda  disinari dengan seberkas cahaya dan sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang biasa disebut dengan efek fotoelektrik dengan kondisi hampa udara.

Elektron yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi yang timbul dan dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -focused type) secara berurutan dan keluar mengenai anoda. Elektron tersebut terikat dalam logam dengan energi W (eV), yang dikenal sebagai fungsi kerja (work function), logam yang berbeda memilki fungsi kerja yang berbeda pula. Dan logam katoda yang digunakan sebagai permukaan fotosensitif, dibawah panjang gelombang pancung  (cutoff  wavelength)  λc, sembarang sumber cahaya, selemah apapun, akan menyebabkan terjadinya pemancaran fotoelektron.    

Cahaya yang masuk difokuskan dengan melewati focusing electrode dan elektron mengenai dynode pertama kemudian dipantulkan dan dipancarkan ke dynode kedua sampai ke dynode yang terakhir (proses pengalian) sehingga terjadi muatan elektron yang lebih besar dan timbul tegangan.  

2.      Monokromator

Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi dengan satu panjang gelombang. Monokromator untuk radiasi ultra violet, sinar tampak dan infra merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan prisma atau grating. Terdapat 2 macam monokromator yaitu monokromator prisma Bunsen dan monokromator grating Czerney-Turney

Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya menjadi sinar monokromatis.   Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah prisma, maka cahaya tersebut akandiuraikan menjadi beberapa warna (terdapat berbagai warna merah, jingga, hijau, biru,  dan lain-lain). 

3.      Absorbansi

Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energy yang diperlukan untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke tingkat tereksitasi (atau dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat padat).   Dengan spektroskopi dari cahaya transmisi bisa diketahui tingkat/pita energi dari suatu atom/molekul/zat padat.

Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian akan terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan menaikan tingkat energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang yang diserapnya.  

Rumus yang digunakan untuk menghitung besarnya energi yang diserap:

E = h x ν = h x C /λ = h x C / v 

dimana, E = energi yang diserap  

                          h = tetapan Planck = 6,626 x 10^-34

                          v = frekuensi 

                          C = kecepatan cahaya = 2,998 x 108 m/det 

                          λ = panjang gelombang  

                          ν = bilangan gelombang 

Absorbansi dengan simbol A dari suatu larutan merupakan logaritma dari 1/T atau logaritma Io/It.

A = log (1/T) = log (Io/It) = -  log (T)        (1.4)

            dimana, A  = Absorbansi / serapan 

                          Io = Intensitas sinar yang datang 

                          It = Intensitas sinar yang diteruskan

                          T = Transmitance / transmitansi   

4.      Transmitansi

Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu larutan dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga intensitas radiasi yang  diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io.  Transmitansi dengan simbol T dari larutan merupakan fraksi dari radiasi yang diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan, yaitu : T = It/Io. Transmitansi biasanya dinyatakan dalam persen (%).

2.11 Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Kromatografi Lapis Tipis

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga R_f  adalah :

1.      Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2.      Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan menge­ringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga  R_f meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,   jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap  dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.

3.      Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

4.      Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

5.      Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

6.      Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).

7.      Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terben­tuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga R_f.

8.      Suhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.

9.      Kesetimbangan.

Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih pen­ting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan at­mosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah.

2.12 Aplikasi KLT Pada Bidang Pangan

Pada penelitian analisis kualitastif pewarna rhodamin B dalam sampel saus tomat. Sampel dianalisis dengan metode Kromatografi Lapis Tipis. Zat warna dari sampel saus tomat ditarik kedalam benang wol bebas lemak dalam suasana asam sampai benang wol tersebut terwarnai oleh pewarna saus tomat.

Setelah benang wol terwarnai oleh pewarna saus tomat, pewarna tersebut dilepaskan ke dalam larutan basa. Larutan basa tersebut selanjutnya akan digunakan sebagai cuplikan sampel pada analisis Kromatografi Lapis Tipis. Noda totolan sampel dibandingkan dengan noda totolan baku standar rhodamin B yang telah dieluasi bersama-sama dan dilihat di bawah lampu UV pada λ 366 dan λ 254 nm, apabila terdapat zat pewarna rhodamin B dalam sampel maka noda pada lempeng KLT akan berflouresensi di lampu UV pada λ 366 nm dan tidak berflorousensi dilampu UV pada λ 254 nm, pada penelitian ini noda totolan sampel pada lempeng KLT tidak menunjukan flouresensi di lampu UV pada λ 366 nm, sehingga dapat disimpulan bahwa pada sampel saus tomat ini tidak terkandung zat pewarna rhodamin B

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

1.   Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

2.   KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen,

3.   Keuntungan KLT yaitu ketepatan penentuan kadar baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugiannya memerlukan waktu untuk menentuan sistem eluen yang cocok.

4.   Prinsip KLT yaitu pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.

5.   Pembuatan lapis tipis KLT dimulai dari penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik, biasanya digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi. Seringkali bentuk plat kaca  / aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai “standard”. 

6.   Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.

7.   Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Fasa gerak/eluent yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent).

8.   Kerja dengan KLT dimulai dari penyiapan plat, eluen dan sampel, penotolan, elusi, dan deteksi bercak/noda.

9.   Cara mendeteksi bercak ada 2 yaitu menggunakan UV dan campuran zat kimia tertentu.

10.  Terdapat beberapa instrument pada kromatografi lapis tipis diantaranya adalah detector, monokromator, absorbansi, dan transmitansi.

11.  Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga R_f  adalah :

a.    Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

b.   Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

c.    Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

d.   Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

e.    Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

f.    Teknik percobaan.

g.    Jumlah cuplikan yang digunakan.

h.   Suhu

i.     Kesetimbangan.

12.  Aplikasi KLT pada bidang pangan adalah pada penelitian analisis kualitastif pewarna rhodamin B dalam sampel saus tomat.

3.2 Saran

1. Bagi Pemerintah

Dalam rangka meningkatkan ketahanan pangan Indonesia hendaklah pemerintah memperhatikan kualitas pangan Indonesia serta agar terus mengembangkan teknologi yang menunjang pada penelitian dalam bidang pangan.

2. Untuk Mahasiswa

Memberikan nuansa baru dalam menambah wawasan pengetahuan yang memungkinkan mahasiswa berkesempatan untuk memperbaiki cara dan sikap dalam memahami materi kromatografi lapis tipis.

Daftar Pustaka

Arifin, Fury. 2012. Kromatografi Lapis Tipis. http://nonasandha.blogspot.com. Diakses : 03 Desember 2014

Ayu. 2013. Analisa Pengukuran Kadar Larutan. http://s1farmasiayu.blogspot.com. Diakses : 03 Desember 2014

Clark, Jim. 2007. Kromaografi Lapis Tipis. http://www.chem-is-try.org. Diakses : 03 Desember 2014

Khopkar, SM. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia Press.

Nurhidayat, Iim. 2011. Kromaografi Lapis Tipis. http://sectoranalyst.blogspot.com. Diakses : 03 Desember 2014

Sendana, Endra. 2013. Kromatografi Lapis Tipis. http://ndrasendana.blogspot.com. Diakses : 03 Desember 2014